Scientific Abstract
Chronic inflammatory bowel disease (IBD) with its two main subforms, Crohn’s disease and ulcerative colitis, is an increasingly frequent health problem of the Western world, in particular affecting young patients. Until today there is no causal therapy available, because the causes of IBD are unknown. Studies about the etiology of IBD imply that the disease develops from altered function or structure of the intestinal epithelium, leading to the inflammation-prone interaction of the immune system with the intestinal microbiota. Recent publications demonstrate changes in the intestinal microbiota of IBD patients and some indicate that microorganisms might be able to induce IBD or even transfer the disease to healthy individuals. However, neither microorganisms have so far been dissected that cause IBD, nor have factors or gene products been identified that might play a role in the process. The enormous complexity of the intestinal microbiota and the inability to culture most of the microorganisms requires the application of high throughput metagenomic and postgenomic technologies in order to decipher the role of microbes in IBD.
Here we propose a highly integrative project aimed to elucidate the impact of chemically or genetically induced IBD on the mouse gut microbiota. Our experiments will for the first time examine both the composition of the microbiota, through study of the mouse intestinal microbial metagenome using highly parallel sequencing of 16S rRNA tags and genome fragments, and the global microbial gene expression pattern, through study of the global intestinal microbial metatranscriptome by differential cDNA analysis. The identified candidate colitogenic microorganisms and IBD-associated transcripts will be subsequently monitored in their abundance during IBD progression and their genomic context will be studied in detail by sequencing large-insert BAC clones. The ecophysiology of potential colitogenic species will be determined employing cutting-edge stable isotope-labelling techniques for microbial community and single cell analysis. In addition, the relevance of identified colitogenic species will be examined through the presence of characteristic marker proteins in hundreds of tissue samples from IBD patients using state-of-the–art multicolour immunofluorescence microscopy.
In parallel to our analysis of the intestinal microbiota, we will monitor the pathological and immunological changes of the gut mucosa and the underlying lamina propria and determine an IBD score which can later be correlated with changes in the microbiota. Genetically modified mice will help to clarify the impact of specific immunodeficiencies on the appearance of colitogenic microbiota or the induction of colitogenic transcripts. To determine the transmittability of the colitogenic microbiota, diseased mice will be co-housed with healthy wildtype animals.
The interdisciplinary research consortium of this project includes high profile experts in pathology, mouse genetics, immune biology, microbial genomics, and microbial ecology. In a collaborative effort, we aim to establish a reproducible experimental system, which we will exploit for systematic and comprehensive studies to monitor IBD disease in correlation with its associated microbiota.
Wissenschaftliche Zusammenfassung
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease, IBD: z.B. Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa) betreffen vorwiegend junge Patienten. Sie sind in der westlichen Welt häufig und nehmen in der Frequenz noch immer stark zu. Bis heute gibt es keine kausale Therapie, da die Ursachen der IBD nicht bekannt sind. Eine Reihe von Studien zur Ätiologie der IBD belegen, dass es sich hierbei um eine gestörte Wechselwirkung des Immunsystems mit der mikrobiellen Darmbiota handelt, die ein Ergebnis einer veränderten Funktion und Struktur des Darmepithels ist. Kürzlich erschienene Publikationen zeigen, dass IBD-Patienten eine veränderte mikrobielle Darmbiota aufweisen und dass möglicherweise bestimmte Mikroorganismen IBD induzieren und eventuell sogar auf gesunde Individuen übertragen können. Allerdings konnte bislang nicht entschlüsselt werden, welche Mikroorganismen IBD verursachen und welche mikrobiellen Genprodukte hierbei eine Rolle spielen. Die enorme Komplexität der Darmmikrobiota und die Nicht-Kultivierbarkeit der meisten Mikroorganismen erfordert die Anwendung von Hochdurchsatzmethoden der Metagenomik und postgenomischer Technologien, um die Rolle von Mikroorganismen bei IBD aufklären zu können.
Dieses Projekt soll klären, welchen Einfluss eine chemisch erzeugte oder durch genetische Prädisposition eintretende IBD in Mäusen auf die Mikrobiota des Darms nimmt. Zum ersten Mal wird dabei mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung von 16S rRNA Signaturen und Genomfragmenten der Einfluss auf die Zusammensetzung der Darmbiota der Maus (durch Analyse des intestinalen mikrobiellen Metagenoms) überprüft und parallel dazu die globale mikrobielle Genexpression (durch Studium des globalen intestinalen mikrobiellen Metatranskriptoms) mittels differentieller cDNA Analyse untersucht. Die Abundanz potenziell colitogener Mikroorganismen und IBD-assoziierter Transkripte wird dem Verlauf der intestinalen Entzündung zugeordnet. Zudem wird ihr genomischer Kontext durch Sequenzierung von BAC-Klonen mit großen genomischen Inserts im Detail analysiert. Neueste, Isotopen-basierte Markierungsverfahren werden zur Untersuchung komplexer mikrobieller Gemeinschaften und einzelner Mikroben eingesetzt um erste Einblicke in die Ökophysiologie von potenziell colitogenen Arten zu erhalten. Hierauf basierend wird die Relevanz der gefundenen colitogenen Species für die humane IBD durch das Auftreten charakteristischer Marker an hunderten IBD Patientenproben mittels modernster Multicolor- Immunfluoreszenz- Mikroskopie überprüft.
Flankierend zur Analyse der intestinalen Mikrobiota werden pathologische und immunologische Veränderung der Darmschleimhaut und der darunter liegenden Lamina propria ermittelt und ein IBD ‚score’ festgestellt, der eine Korrelation des Krankheitsverlaufs mit Veränderungen der mikrobiellen Biota ermöglicht. Durch Verwendung genetisch veränderter Mäuse wird der Einfluss spezifischer Immundefizienzen auf das Auftreten colitogener Mikrobiota bzw. colitogener Genexpression ermittelt. Zur Überprüfung der Übertragbarkeit der colitogenen Darmbiota werden Mäuse nach Auslösen der IBD mit gesunden Empfängertieren in gemeinsamen Käfigen gehalten.
Die hier formierte interdisziplinäre Forschergruppe besteht aus renommierten Experten der mikrobiellen Ökologie, mikrobiellen Genomik, Mausgenetik, Immunbiologie, Maus- und Humanpathologie. In enger Zusammenarbeit beabsichtigen wir, ein reproduzierbares und umfassendes experimentelles System für IBD zu etablieren. Die systematische Erfassung von Genen und Proteinen, die für die Entstehung der humanen Erkrankung relevant sind, wird zu einer umgehenden Anwendung der erworbenen Erkenntnisse in Diagnostik und Therapie führen.
